Среди Святынь храма Спаса на Городу особо почитается фресковый образ Спаса Всемилостивого. По преданию, этот образ ранее находился на Подзеленской башне городского Кремля. После разрушения стен при императрице Екатерине II, образ вместе с кирпичной кладкой был перенесен в южный предел. После возобновления богослужений в 2004 году он был снят при настоятеле храма иеромонахе Сергие ярославскими реставраторами, и после реставрации помещен в напольном киоте за правым клиросом.

    Другой важной Святыней Храма является Большой мощевик с частицами 131 Святого Угодника Божия и частицей Животворящего Древа Креста Господня, заключенный в серебряный Крест-мощевик.

 Также в храме особо почитается икона Пресвятой Богородицы «Умягчение злых сердец» (Семистрельная). В клеймах этой иконы находятся изображения многочисленных святых (в том числе Святой Равноапостольной Марии  Магдалины и Блаженной Матроны Московской с частицами мощей этих Святых Угодников Божиих).

   В храме находится список с иконы Симона Ушакова «Святая Новозаветная Троица». В нижнем поле этой иконы находится желудь от Мамврийского дуба, привезенный паломниками в 19 веке, когда Маврийский дуб был живым.

  Особо почитается в храме икона Преподобного Серафима Саровского с частицей его Святых мощей. Икона была подарена в ноябре 2004 года в самом начале возобновления приходской жизни одной московской учительницей.

   В алтаре храма в особом Ковчеге находится частица мощей Преподобного Серафима Саровского, переданная по благословению Святейшего Патриарха Алексия II в 2003 году из Дивеевской обители Нижегородской Епархии.

   В храме находится уникальный и единственный в Ярославле подобный образ «Всех Святых», написанный к тысячелетию г. Ярославля и освященный в 2010 году. На иконе  изображены 998 Святых Угодников Божиих и 101 изображение Пресвятой Богородицы. В среднике иконы помещен  Образ Пресвятой Богородицы «Всецарица» (Пантанасса), особо почитаемый в последнее время в связи с ростом онкологических заболеваний.

      Выделяются среди икон храма две большие иконы с ризами, вышитыми бисером прихожанами во главе с настоятелем. Это икона Пресвятой Богородицы «Скоропослушницы» и икона Святого Великомученика и целителя Пантелеимона. В той иконе в нижнем правом углу находится мощевик  с частицей его Святой Главы, привезенной со Святой Афонской горы ныне почившим архимандритом Авелем Македоновыми и переданной настоятелю.